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Santé

MMP8 circulante dérivée de la myéloïde dans la susceptibilité au stress et la dépression

Souris

Les souches de souris suivantes ont été utilisées : Pour les expériences CSDS standard, des souris C57BL/6 J âgées de 7 semaines (numéro de stock 000664) ont été achetées auprès du Jackson Laboratory. Pour les expériences de transplantation de moelle osseuse, B6.SJL- âgé de 4 semainesPtprcun Pepcb/BoyJ (numéro de stock 002014, B6 CD45.1) ont été obtenues auprès du Jackson Laboratory. B6.129(Cg)-Ccr2tm2.1Ifc/J (code commande 017586, Ccr2appel d’offres) et B6.129×1-Mmp8tm1Otin/J (code commande 005514, Mmp8−/−) ont été élevés en interne. Mâles retraités de quatre à six mois reproducteurs CD-1 (Charles River Laboratories, Crl:CD1[ICR]) ont été utilisés comme agresseurs pour les CSDS mâles. Pour l’expérience CSDS femelle, mâle B6N.129S6(Cg)-Esr1tm1.1(cre)Et/J (code commande 017911, Èrecre (ERa est également connu sous le nom de Esr1)) des souris ont été achetées au Jackson Laboratory et ont été croisées avec des femelles CD-1 pour obtenir F1 les mâles, qui étaient utilisés comme agresseurs. Les souris achetées auprès de fournisseurs externes ont été autorisées à s’habituer à l’animalerie pendant au moins une semaine. Les souris ont été maintenues selon un cycle lumière: obscurité de 12 h (lumières allumées à 7h00, lumières éteintes à 19h00) avec un accès à volonté à la nourriture et à l’eau. Pour tous les tests comportementaux, les souris ont pu s’acclimater à la salle de test pendant au moins 1 h. Toutes les procédures ont été effectuées conformément au Guide des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et au Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’École de médecine Icahn du Mont Sinaï (ISMMS).

Test CSDS et SI

Pour les CSDS masculins19, des reproducteurs mâles CD-1 à la retraite (âgés de 4 à 6 mois) ont été utilisés comme agresseurs. Avant chaque défaite, les agresseurs ont été examinés pour leur comportement agressif pendant trois jours consécutifs sur la base des critères décrits précédemment.19. Deux jours avant le début de la défaite, des souris CD-1 étaient hébergées sur un côté d’une cloison en plexiglas perforée. Pendant 10 jours consécutifs de CSDS, des souris expérimentales (âgées de 7 à 8 semaines) ont été soumises à une interaction physique directe avec un CD-1 pendant 10 minutes par jour (5 minutes pour les cohortes de chimères de moelle osseuse), et le reste de la journée a été placé sur l’autre côté du séparateur en plexiglas, permettant un contact sensoriel mais pas physique direct. Agresseurs masculins pour CSDS féminines61,62 ont été générés comme suit : Hétérozygotes ERa-cre des souris ont reçu une injection bilatérale d’un AAV-DIO-hM3D (Gq) -DREADD dépendant de Cre (Addgene, 44361-AAV2) dans la subdivision ventrolatérale de l’hypothalamus ventromédian. Pour activer ERα+ cellules, injections intrapéritonéales de 1,0 mg kg−1 clozapine-N-oxyde (Tocris, 4936) ont été administrés 30 minutes avant chaque épisode de défaite. Les souris témoins non stressées ont été hébergées par paires sur une cloison en plexiglas. Après le dernier jour de défaite, les souris témoins stressées et non stressées ont été hébergées individuellement (mâles) ou par paires (femelles). Toutes les souris stressées ont été soigneusement examinées à la recherche de blessures au cours des expériences CSDS et les souris présentant des blessures excessives ont été exclues.

Contrainte inférieure au seuil

Le stress inférieur au seuil est une variante du paradigme CSDS qui est utilisé pour démêler les facteurs favorables à la susceptibilité.32 sans provoquer de modifications comportementales chez les souris non manipulées. Les souris expérimentales ont été exposées à 3 périodes de 5 minutes d’interactions physiques directes avec une souris CD-1 agressive avec un intervalle de 15 minutes entre les défaites. 24 heures après le dernier combat de défaite, le test SI a été réalisé comme décrit ci-dessous.

Test SI

Le test SI a été effectué 24 h après la dernière session de défaite dans des conditions de feu rouge. Après une période d’habituation d’une heure à la suite comportementale, les souris ont été placées dans une arène en plexiglas (42 cm × 42 cm × 42 cm, Nationwide Plastics) avec une petite enceinte grillagée à une extrémité. Pendant les 2,5 premières minutes, la souris expérimentale a librement exploré l’arène. La souris a ensuite été retirée de l’arène qui a ensuite été nettoyée avec de l’éthanol à 70 %, puis une nouvelle cible sociale (CD-1 pour les mâles et les femelles). Èrecre pour CSDS femelle) a été placé dans l’enceinte et la souris expérimentale a été replacée dans l’arène pendant 2,5 minutes supplémentaires. L’activité locomotrice a été suivie et enregistrée à l’aide d’un système Noldus Ethovision (Noldus Information Technology, version 11.0). Le rapport SI a été calculé comme le rapport entre le temps passé par la souris expérimentale à proximité de l’enceinte (zone SI) lorsqu’une souris cible était présente et absente. Les souris avec un rapport SI ≥ 1 présentent un profil comportemental similaire à celui des souris témoins non stressées et ont été qualifiées de résilientes, tandis que les souris avec un rapport SI < 1 ont été qualifiées de sensibles. Pour tester le comportement d'évitement social envers une souris juvénile, le test SI a été réalisé comme décrit ci-dessus avec une souris juvénile mâle âgée de quatre à six semaines comme cible sociale. Les paramètres supplémentaires mesurés étaient la locomotion totale et le temps passé dans les coins, calculés comme la somme entre les deux coins opposés à l'enceinte grillagée.

Stress variable chronique

Un stress variable chronique a été réalisé chez des souris femelles comme décrit précédemment63. Pendant 21 jours, les souris ont été exposées quotidiennement à des facteurs de stress d’une heure, consistant soit en 100 chocs légers au pied (0, 45 mA), en un stress de contention dans un tube Falcon de 50 ml ou en une suspension de la queue. Pendant toute la durée du stress, les souris ont été hébergées en groupe.

Injection intrapéritonéale de rMMP8

Avant l’injection, rMMP8 (Bio-techne, 2904-MP-010) a été activé ex vivo pendant 1 h à 37 ° C avec 1 mM d’acétate de 4-aminophénylmercurique (APMA) dans un tampon de test contenant du mercure (Anaspec, AS-71154) et puis dilué dans une solution saline stérile à 0,9 % (VWR, 101448-952). Pour l’expérience dose-réponse, nous avons injecté trois doses différentes de 50, 100 et 200 µg kg−1, et le sang a été prélevé 20 minutes après l’injection via un saignement sous-maxillaire et 18 heures après l’injection avec du sang du tronc. La MMP8 a été mesurée comme décrit ci-dessous. Pour les expériences comportementales, des souris ont reçu une injection de 100 µg kg−1 rMMP8 ou APMA 20 min avant le combat de défaite.

Chirurgies stéréotaxiques, transfert de gènes viraux ou perfusions chroniques d’hyaluronidase

Les interventions chirurgicales ont été réalisées comme décrit précédemment23. En bref, des souris C57BL/6 J âgées de 6 semaines ont reçu une injection intrapéritonéale d’un mélange de chlorhydrate de kétamine (100 mg kg−1 poids corporel) et xylazine (10 mg kg−1 poids corporel). Une fois l’anesthésie confirmée, les souris ont été placées sur un instrument stéréotaxique (David Kopf Instruments). Pour le Cldn5 expérience de knockdown, nous avons injecté bilatéralement 0,5 μl de virus (1,0 × 1011 unités infectieuses par ml) exprimant soit AAV2/9-shRNA, soit AAV2/9-shRNA-Cldn5 dans la NAc (coordonnées depuis bregma : AP + 1,5 mm ; ML ± 0,5 mm ; DV − 4,4 mm). Après 2 semaines de récupération, les souris ont reçu de la doxycycline (2 mg ml−1 dans l’eau potable) pendant encore 2 semaines. Pour l’expérience de perfusion de hyaluronidase, 27 canules guides G ont été insérées bilatéralement dans le NAc (à partir de bregma : AP + 1,5 mm ; ML ± 0,5 mm ; DV – 4,4 mm) et fixées sur le crâne à l’aide de ciment dentaire (Grip cement ; Dentsply). Après deux semaines de récupération, des perfusions quotidiennes de 5 U de hyaluronidase (Sigma-Aldrich, H1136) ou de solution saline ont été effectuées une fois par jour pendant 10 jours consécutifs. Tous les composés et virus ont été perfusés à raison de 0,1 μl min−1 et laissé diffuser passivement pendant 5 minutes avant de retirer les aiguilles.

Génération de chimères de moelle osseuse

Des chimères de moelle osseuse ont été générées comme décrit10,28. Pour procéder à l’ablation du système immunitaire périphérique de la souris hôte, des souris mâles B6 CD45.1 âgées de 5 semaines ont été irradiées avec un total de 11 Gy, administrées en deux doses de 5,5 Gy, espacées de 3 à 4 h (X-rad 320 Irradiator (Rayons X de précision)). Des cellules progénitrices hématopoïétiques ont été isolées du fémur/tibia de l’un ou l’autre Mmp8−/− ou Mmp8+/+ souris donneuses mâles (âgées de 12 semaines). Une heure après la deuxième dose d’irradiation, 1 × 106 les cellules ont été injectées par voie rétro-orbitale à des souris anesthésiées à l’isoflurane. Les souris hôtes ont ensuite pu récupérer pendant six semaines au total. Les souris ont reçu un traitement antibiotique (0,2% dans l’eau potable) (trisulfate de néomycine, N1876, Sigma) pendant les trois premières semaines de récupération. Le niveau de chimérisme a été évalué par cytométrie en flux, en comparant CD45.1 (hôte) (anti-CD45.1-PE-Cyanine7 de souris, clone A20, Invitrogen, 25-0453-81) et CD45.2 (donneur) (anti-CD45.1-PE-Cyanine7 de souris, clone A20, Invitrogen, 25-0453-81). -CD45.2-BV421, clone 104, BD Bioscience, 562895) leucocytes, et mesure de MMP8 dans le plasma (Abcam, ab206982).

PPcs

Le sCPP a été réalisé comme décrit64. L’expérience a été réalisée dans des conditions de lumière rouge après que les souris se soient habituées à la salle CPP pendant 1 h. La chambre du CPP (Med Associates) se composait de 3 compartiments différents : une partie médiane neutre et deux chambres adjacentes, chacune avec des sols (grille) et des murs distincts. Le jour du pré-test, les souris ont été autorisées à explorer les trois chambres pendant 20 minutes et le temps passé dans chaque chambre a été enregistré. Sur la base de ces durées, les souris ont été équilibrées pour tenir compte des préférences pré-test. Au cours des quatre jours de conditionnement consécutifs, les souris ont été conditionnées deux fois par jour : le matin, les souris ont été placées dans une chambre pendant 15 minutes avec une nouvelle souris juvénile de même sexe (âgée de 4 à 5 semaines) C57BL/6 J (chambre appariée). ). Dans l’après-midi, la souris expérimentale a été placée dans la chambre vide opposée pendant la même durée (chambre non appariée). Le jour du test, les souris ont de nouveau été autorisées à explorer librement toutes les chambres pendant 20 minutes et le temps passé dans chaque chambre a été automatiquement enregistré (Med Associates).

Test de préférence pour le saccharose

Un test de préférence au saccharose a été réalisé pour évaluer le comportement hédonique envers un stimulus gustatif sucré11. Les souris ont eu accès à deux bouteilles d’eau (tubes coniques de 50 ml avec bouchons) pendant 24 h pour s’habituer. Ensuite, une bouteille d’eau a été remplacée par une bouteille contenant 1 % de saccharose (Sigma, S0389) dans de l’eau potable. Après 24 h, les positions des bouteilles ont été permutées pour éviter les biais de position. Après 24 heures supplémentaires, la préférence pour le saccharose a été évaluée comme suit (en fonction du poids des bouteilles) : (saccharose (g)/liquide total (g)) × 100 %.

Test d’éclaboussure

Le test d’éclaboussure, un test effectué pour évaluer le comportement en matière de soins personnels, a été réalisé dans des conditions de lumière rouge, comme décrit précédemment.11. En bref, après 1 heure d’habituation à la salle de test, une solution de saccharose à 10 % a été doucement pulvérisée sur le bas du dos de la souris. Le comportement a été enregistré pendant 5 minutes et le temps passé à se toiletter a été noté.

Test EPM

L’EPM a été réalisé pour évaluer les comportements de type anxieux11. Après 1 heure d’habituation à la salle de test, les souris ont été placées dans un labyrinthe en forme de croix surélevé pendant 5 minutes dans des conditions de lumière rouge. Les quatre bras (deux bras…

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